qPCR样所有PCR方法 - 扩增核酸，但qPCR也实时监测过程。当qPCR工作时，科学家必须设计和验证测定。这在该过程的各个方面造成各种挑战。
“Promega（麦迪逊，威斯康星）研究和开发小组的**研究科学家Rod Pennington说：”在设计一个qPCR测定中心对选择引物和探针序列以及报道染料，尤其是多重测定中的关键挑战。“此外，寡核苷酸序列的选择和与可用的实时qPCR仪器兼容的检测化学物质可能是一种困难的平衡作用。”他补充说，“多重测定中希望检测的目标越多，平衡作用越不稳定可。”
另外的挑战进一步使设计阶段复杂化。例如，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）遗传分析的**产品经理Karen Li指出需要获得**新的序列信息，避免“序列变异，包括SNP，插入，缺失和低复杂性序列“。有了这些信息，Li说，科学家然后需要确保”测定靶向独特的序列，并且不会靶向基因组中的多个斑点。
靶标的特征影响PCR的工作程度。“在查看转录本时，**好在外显子 - 外显子连接处设计分析，以便不会检测目标基因组DNA。”Li解释说。“考虑是否需要检测一个特定的转录本，或者如果你想检测同一个基因的转录本变异。”她补充说，“对于转基因实验，确保你正在查看物种特异性靶点。
qPCR技术的一些进展使得更容易设计新的测定法。“具有多个检测通道的qPCR仪器可以在一定程度上简化测定设计，通过扩展设计寡核苷酸和探针的选项，”Pennington说。“在试剂方面，新的探针化学物质继续被引入，并增加了测定设计的灵活性。
科学家也可以依靠现有的qPCR测定。如Li所说，“我们有广泛和不断增长的预先设计的TaqMan分析的选择，其跨越一系列应用 - 基因表达，SNP检测，拷贝数分析等，其使用广泛的生物信息学分析设计，使用**新的序列信息来自公共数据库，并对测定设计进行计算机质量控制以应对这些挑战。
对于新的qPCR测定，请考虑使用设计工具。正如李先生指出的，“有许多测定设计工具可以帮助定制化验设计。”她补充说，“我们的定制化验设计工具--www.Thermofisher.com/ cadt-具有'定制加'管道选项将执行在我们预设计的测定法上进行的相同的生物信息学分析“。例如，该工具通常设计具有较小扩增子的分析，以在PCR反应中获得更好的效率，并且为转基因实验和转录物特异性靶标提供选择。
一旦科学家设计了一种测定，还有更多的工作要做，如优化它。“qPCR测定的成功取决于必须优化大量变量，例如组分浓度和热循环参数，”Pennington解释说。“qPCR测定的优化矩阵可能非常复杂，应包括代表性样品材料的测试。
所需的优化级别取决于设计的质量。“良好的测定设计对于**大限度减少优化qPCR测定所需的工作**关重要，”Li说。“如果不注意在均匀的温度下设计引物和探针，优化可能会有挑战性。”如果设计不够仔细，则需要更多的工作来尽可能高效地运行测定。As Li解释说，“如果您不进行优化您的测定设计的前期工作，您将需要优化您的PCR反应，以找到**佳的退火/延伸温度，不仅适用于您的引物和探针，你的主人混合和仪器。
在某些情况下，优化可能比在其他情况下更难。Pennington说：“如果样品材料难以获得，测定优化实验材料的可用性可能会有问题。
为了在优化的**佳结果，科学家可能寻求qPCR技术的具体功能。“具有高通量潜力的仪器可以帮助优化，”Pennington说。“高通量潜力可能来自快速热循环，容易与机器人移液站接口或其他功能。”同时运行多个热循环曲线也可加快科学家优化测定的速度。
试剂也影响优化。“新的主混合产品相当频繁地引入，并且在某些情况下允许从优化矩阵中去除某些参数，例如MgCl 2或酶浓度，”Pennington解释说。“这可以减少实验所需的实验范围。
在经过设计和优化qPCR测定的步骤后，需要对其进行验证，以证明它真正做到了应该做的事情。BioNTech Diagnostics（德GMainz）分子诊断科学家Mark Laible说：“从我的角度来看，qPCR测定验证中**具挑战性的部分是由不同qPCR平台引入的方差评估。“注意到您开发的测定仪器类型容易出现大的仪器间变化，这可能非常令人失望。
为了减少这种问题的可能性，他说，**好是“在技术开发早期选择仪器间差异较小的仪器”。Laible说，要做这样的选择，应该**少“三种不同仪器的特定型号“。他补充说，”大多数仪器制造商都有助于让您与其他实验室接触。
验证所需的努力通常取决于手头的应用。在许多情况下，市售的测定法将完成这项工作。然而，当需要时，可以开发用于特定应用的全新的qPCR测定。通过合适的qPCR和试剂，加上经验和设计工具，科学家可以设计，优化和验证测定。
